Meteor & Meteor 2.0 光電關(guān)聯(lián)CryoFIB集成熒光顯微鏡

前言

冷凍電子斷層掃描(cryo-ET)是一種非常強(qiáng)大的技術(shù)，可以在接近天然狀態(tài)下以高分辨率研究細(xì)胞景像。近年來(lái)，該技術(shù)越來(lái)越受歡迎，越來(lái)越多的研究小組正在他們的實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施它。冷凍電子斷層掃描的強(qiáng)大功能是毋庸置疑的，但該工作流程非常容易出錯(cuò)，這限制了數(shù)據(jù)產(chǎn)出。在工作流程中，有兩個(gè)主要挑戰(zhàn)：保持樣品無(wú)冰污染和目標(biāo)感興趣區(qū)域(ROI)。荷蘭Delmic開(kāi)發(fā)了兩種名為CERES和METEOR的工作流程解決方案，以簡(jiǎn)化整個(gè)冷凍電子斷層掃描制備工作流程。CERES Ice Defence System由多種創(chuàng)新工具組成，這些工具專(zhuān)為最大限度地減少樣品處理(Clean Station)、轉(zhuǎn)移(Vitri-Lock)和CryoFIB研磨冷凍薄片(Ice Shield)過(guò)程中的冰晶污染而量身定制。METEOR是一種集成的熒光光學(xué)顯微鏡(FLM)，可大大提高冷凍 FIB/SEM制備薄片的良率，同時(shí)減少所需的處理步驟數(shù)。實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)合這些創(chuàng)新工具可以提高冷凍電子斷層掃描數(shù)據(jù)質(zhì)量和通量。METEOR 2.0是METEOR升級(jí)版。

METEOR系統(tǒng)介紹

METEOR是一款獲獎(jiǎng)的熒光顯微鏡（FLM），可以直接集成到特定的冷凍聚焦離子束（FIB）/掃描電鏡（SEM）腔室中。METEOR支持原位冷凍光電聯(lián)用（cryo-CLEM），并能輕松適應(yīng)您的工作流程。它不僅減少了顯微鏡之間的轉(zhuǎn)移步驟，保護(hù)脆弱的樣品免受不必要的污染，還允許您在銑削過(guò)程中和之后成像感興趣區(qū)域（ROI）。通過(guò)減少當(dāng)前繁瑣的工作流程中的轉(zhuǎn)移步驟，METEOR可以大大降低冷凍關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)工作流程的復(fù)雜性。您的樣品薄切片制備工作流程將簡(jiǎn)化到7個(gè)制造步驟：加載樣品，然后捕獲熒光顯微圖像和掃描電鏡圖像，且無(wú)需進(jìn)行樣品轉(zhuǎn)移，在系統(tǒng)將兩個(gè)圖像自動(dòng)關(guān)聯(lián)后，直接移至目標(biāo)區(qū)域，在完成薄切片研磨之后，用熒光顯微鏡確認(rèn)感興趣區(qū)域是否完好。

對(duì)于冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）工作流程，這使得驗(yàn)證感興趣區(qū)域（ROI）是否包含在樣品中成為可能。不僅來(lái)自樣品的熒光標(biāo)記（FLM）信號(hào)確認(rèn)了目標(biāo)蛋白質(zhì)正在通過(guò)冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）被解析，它還使寶貴的透射電鏡（TEM）機(jī)時(shí)能更好地用于有用的樣品。在“銑削和觀(guān)察”工作流程中，隨著更多材料被銑削，可在原位獲取熒光標(biāo)記（FLM）數(shù)據(jù)，從而在整個(gè)生物材料體積中提高功能和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的相關(guān)性。

冷凍cryo-ET和體積冷凍CLEM在細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)和藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域都能揭示新的見(jiàn)解。通過(guò)冷凍電鏡獲得的深刻見(jiàn)解有助于在接近天然的細(xì)胞環(huán)境中以亞納米分辨率揭示生物結(jié)構(gòu)。不僅無(wú)需蛋白質(zhì)純化，該技術(shù)還允許觀(guān)察蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-藥物相互作用。因此，冷凍電鏡有可能提供更有效和針對(duì)性的藥物設(shè)計(jì)流程，并加速藥物開(kāi)發(fā)進(jìn)程。借助體積CLEM，可獲取整個(gè)細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)信息，提供更全面的視角。細(xì)胞器形態(tài)的變化及其分布可輕松追溯到蛋白質(zhì)表達(dá)的水平和位置。

很不幸，通過(guò)冷凍cryo-ET和體積cryo-CLEM獲取有用見(jiàn)解的速度受到了其復(fù)雜流程的阻礙。當(dāng)前工作流程包括先用獨(dú)立的冷凍熒光顯微鏡cryo-FLM對(duì)樣品進(jìn)行成像，再將其轉(zhuǎn)移到cryo-FIB設(shè)備中，這一過(guò)程可能會(huì)非常繁瑣和令人沮喪。樣品轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能造成的樣品損壞和污染，以及在材料被銑削去除時(shí)難以檢查樣品，這些都對(duì)成功獲取良好數(shù)據(jù)造成了嚴(yán)重影響。這些挑戰(zhàn)以及冷凍cryo-ET和體積冷凍關(guān)聯(lián)顯微鏡CLEM的巨大潛力，激勵(lì)我們開(kāi)發(fā)解決方案，以簡(jiǎn)化流程并讓研究者充分發(fā)揮潛力。

使用METEOR引導(dǎo)薄片制備時(shí)，用戶(hù)首先將樣品裝載至配備METEOR的cryo-FIB中。隨后將電鏡載物臺(tái)移至METEOR位置，獲取全景圖像和高精度Z軸堆棧，從而定位目標(biāo)區(qū)域(ROI)。接著移動(dòng)載物臺(tái)至SEM位置采集同一ROI的SEM圖像。通過(guò)圖像關(guān)聯(lián)分析，用戶(hù)可確定薄片制備位置并啟動(dòng)銑削。在銑削過(guò)程中及完成后，均可根據(jù)熒光信號(hào)驗(yàn)證薄片中的ROI存在性，之后再將樣品轉(zhuǎn)移至冷凍透射電鏡(cryo-TEM)。薄片的熒光顯微鏡(FLM)信號(hào)不僅能確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)正被冷凍電子斷層掃描(cryo-ET)解析，還可確保寶貴的透射電鏡(TEM)機(jī)時(shí)僅用于有用的樣品。

在三維冷凍光電聯(lián)用成像中，樣品首先通過(guò)METEOR進(jìn)行成像以確定目標(biāo)區(qū)域(ROI)。隨后使用掃描電鏡(SEM)獲取ROI的高對(duì)比度圖像，接著用聚焦離子束(FIB)刻蝕樣品表層，之后再次使用SEM對(duì)剛暴露的表面進(jìn)行成像。這種"銑削-觀(guān)察"工作流程將在整個(gè)樣品體積內(nèi)重復(fù)進(jìn)行。借助METEOR，隨著更多材料被銑削去除，可以持續(xù)監(jiān)測(cè)ROI的熒光信號(hào)，從而在整個(gè)生物材料體積內(nèi)實(shí)現(xiàn)功能與結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)性?xún)?yōu)化。

METEOR系統(tǒng)由3個(gè)主要部分組成：電子機(jī)架（放置在顯微鏡房間內(nèi)）、主體（安裝在FIB/SEM聚焦離子束雙束電鏡的一個(gè)端口上）和電鏡腔室內(nèi)光學(xué)器件（安裝在FIB/SEM腔室內(nèi)）。METEOR系統(tǒng)配有一臺(tái)控制PC及一套ODEMIS采集軟件，用于系統(tǒng)控制及熒光圖像的采集。

Delmic冷凍解決方案還包括：

CERES Clean Station 清潔的制備工作站: 在定制的高效清潔站中制備低溫EM樣品，以完全防止冰污染；每一步都在無(wú)水手套箱（濕度<1%/1ppm水）中輕松制備低溫EM樣品。

CERES Ice Shield 冰盾：在冷凍薄片制備過(guò)程中提供終極保護(hù)，防止冰污染；采用專(zhuān)有技術(shù)，在薄片研磨過(guò)程中保護(hù)您的低溫樣品免受寄生冰的生長(zhǎng)；使冷凍FIB制備更多無(wú)冰污染的薄片，以獲得高質(zhì)量的斷層圖像和高通量。

CERES Vitri-Lock 高真空低溫傳輸模塊：可實(shí)現(xiàn)安全無(wú)冰污染的低溫樣品轉(zhuǎn)移；在CERES制備工作站和CryoFIB之間在高真空下傳輸?shù)蜏貥悠罚员M量減少轉(zhuǎn)移過(guò)程中水分的存在；采用主動(dòng)冷卻方式，樣品可以保持玻璃化狀態(tài)長(zhǎng)達(dá)30分鐘。

METEOR 2.0 系統(tǒng)介紹

METEOR 2.0是新一代冷凍熒光顯微鏡系統(tǒng)，專(zhuān)為無(wú)縫集成至冷凍聚焦離子束 (cryo-FIB) 而設(shè)計(jì)。該系統(tǒng)可在高真空腔體內(nèi)直接進(jìn)行熒光成像，省去不必要的樣品轉(zhuǎn)移步驟，從而降低冰污染、樣品失玻璃化以及其他損傷的風(fēng)險(xiǎn)。METEOR 2.0為用戶(hù)提供簡(jiǎn)化且可靠的工作流程，滿(mǎn)足不斷發(fā)展的冷凍電子斷層掃描 (cryo-ET) 研究需求，確保薄片制備過(guò)程高效、精準(zhǔn)且無(wú)污染。

METEOR 2.0結(jié)合大視野成像能力，通過(guò)圖像拼接及自動(dòng)對(duì)焦算法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品潛在銑削區(qū)域的快速篩查。高速濾光輪支持快速多通道成像，單次篩查即可獲取樣品中的所有熒光信號(hào)的全部分布信息。

METEOR 2.0配備高倍、高數(shù)值孔徑物鏡，確保生物結(jié)構(gòu)的高分辨率精細(xì)成像。 系統(tǒng)擁有大視野成像能力，可在保持亞細(xì)胞級(jí)分辨率的同時(shí)觀(guān)測(cè)完整的生物體。單波段濾光片有效減少光譜串?dāng)_，確保標(biāo)記結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)呈現(xiàn)。

METEOR 2.0通過(guò)高數(shù)值孔徑(NA)物鏡的高光子收集能力與優(yōu)化光路設(shè)計(jì)的結(jié)合，確保最大量光子到達(dá)相機(jī)。此外，相機(jī)的高量子效率使這些光子能充分參與成像。 因此，即便最終薄片中最微弱的殘留熒光信號(hào)，也能通過(guò)最小激發(fā)功率被檢測(cè)到，從而有效避免薄片損傷或玻璃化狀態(tài)破壞。

METEOR 2.0可在高真空冷凍 FIB/SEM腔室內(nèi)，實(shí)現(xiàn)FIB銑削后薄片的即時(shí)熒光驗(yàn)證。此功能避免了額外轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的污染，確保樣品保持原始狀態(tài)，同時(shí)提升冷凍電子斷層掃描 (cryo-ET) 的通量效率。

METEOR 2.0搭載ODEMIS軟件，界面友好、直觀(guān)易用且開(kāi)源，旨在優(yōu)化熒光成像流程，提升操作效率與用戶(hù)體驗(yàn)。ODEMIS軟件特點(diǎn)：一鍵切換FIB、SEM和FM成像模式；調(diào)整、保存并重復(fù)調(diào)用成像參數(shù)；通過(guò)冷凍載物臺(tái)導(dǎo)航FM模式；通過(guò)自動(dòng)對(duì)焦，捕獲并拼接大范圍圖像；針對(duì)柵網(wǎng)缺陷調(diào)整自動(dòng)對(duì)焦；實(shí)現(xiàn) SEM 與FM圖像相關(guān)聯(lián)導(dǎo)航；保存ROI的XYZ坐標(biāo)及聚焦位置；支持以 3D TIFF 文件格式采集 z-stack 圖像；與第三方軟件無(wú)縫集成 (MAPS、AutoTEM、ImageJ 等)；免費(fèi)授權(quán)與更新。
使用ODEMIS Viewer可直觀(guān)瀏覽和檢查圖像： 
o Z軸堆棧最大強(qiáng)度投影 
o 直方圖調(diào)整 
o 元數(shù)據(jù)查看 
o 導(dǎo)出帶比例尺的PNG圖像，用于演示或發(fā)表

ODEMIS Advanced是用于精準(zhǔn)自動(dòng)化關(guān)聯(lián)冷凍薄片制備的一體化軟件。ODEMIS advanced是一款開(kāi)源軟件，涵蓋自動(dòng)化關(guān)聯(lián)冷凍薄片制備所需全部功能。集多模態(tài)成像能力與2D/3D關(guān)聯(lián)功能，Odemis Advanced作為一站式平臺(tái)，簡(jiǎn)化相關(guān)冷凍薄片制備流程，免去使用多款軟件的繁瑣。 它在標(biāo)準(zhǔn)版ODEMIS功能基礎(chǔ)上擴(kuò)展，提供以下高級(jí)功能：FIB與SEM成像；簡(jiǎn)化FIB/SEM重合點(diǎn)的標(biāo)定；3D FIB與熒光顯微鏡 (FM)關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)ROI精確定位；自動(dòng)化多位點(diǎn)薄片銑削，支持高通量制備；在薄片區(qū)域?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)熒光檢測(cè)，減少用戶(hù)操作干預(yù)。
METEOR 2.0系統(tǒng)定制：METEOR 2.0在物鏡、相機(jī)、激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射濾光片組上具有高度可定制性，可根據(jù)具體的科研問(wèn)題靈活配置系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)最優(yōu)成像效果。系統(tǒng)配置可根據(jù)不斷變化的研究需求輕松調(diào)整和升級(jí)。我們提供向后兼容的更新方案，確保設(shè)備始終保持最新?tīng)顟B(tài)。

附：Meteor視頻簡(jiǎn)介(中文字幕)